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【流式學(xué)習(xí)】10分鐘梳理流式染色中固定的常見問題

作者：admin 信息來源：達(dá)科為日期：2019年08月21日打印字體：大中小

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固定是為了保持組織/細(xì)胞和活的時(shí)候狀態(tài)一致，在組織學(xué)研究中經(jīng)常會(huì)用到。在流式染色中，有的時(shí)候也會(huì)用到固定，今天就和大家來聊聊流式實(shí)驗(yàn)中固定相關(guān)的一些常見問題。

1. 流式實(shí)驗(yàn)中，哪些情況下需要對細(xì)胞進(jìn)行固定處理？

檢測細(xì)胞內(nèi)指標(biāo)

我們在流式胞內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)，比如檢測細(xì)胞因子（如IFN-γ）或者核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子（如Foxp3）的時(shí)候，在樣本染完表面指標(biāo)后，一般需要先進(jìn)行固定（或者固定破膜一起），然后再進(jìn)行破膜（打孔）以及后續(xù)的胞內(nèi)指標(biāo)染色操作。

延長樣本的保存，獲得充足的上機(jī)時(shí)間。

最常見的情況是染色處理完已經(jīng)到很晚，平臺(tái)老師已經(jīng)下班或者自己的身體已經(jīng)扛不住通宵做實(shí)驗(yàn)了，這個(gè)時(shí)候需要對樣本進(jìn)行固定處理，放到第二天檢測，這里的固是定為了保持檢測指標(biāo)的穩(wěn)定性；另一方面，當(dāng)樣本特別多的時(shí)候，第一管樣本和最后一管樣本的時(shí)間間隔會(huì)很久，這種情況下考慮上機(jī)前做一下固定，保持前后數(shù)據(jù)的一致性，比如CD11b這個(gè)指標(biāo)在白細(xì)胞中的表達(dá)會(huì)隨著樣本放置時(shí)間的增加而上調(diào)。

生物安全性考慮

做流式的同學(xué)們都知道，流式檢測的樣本多種多樣，有可能我們接觸的樣本是疾病相關(guān)的，有的時(shí)候甚至是傳染病相關(guān)的。比如臨床檢測的樣本有可能來自于HIV病人，在這種特殊的情況下，我們希望能夠?qū)颖咀龉潭ㄌ幚砘蛘呤穷A(yù)固定處理，這樣會(huì)大大增加操作人員的安全性。

對蛋白翻譯后修飾的檢測

在蛋白翻譯后修飾（磷酸化、乙?；?、甲基化等）的研究過程中，固定劑不僅可以有效的“固定”住翻譯后修飾的位點(diǎn)（絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸等），也可以防止目標(biāo)位點(diǎn)在活細(xì)胞中很快降解（比如磷酸酶會(huì)去除磷酸化修飾、去甲基化酶會(huì)移除甲基化修飾等）。下面的例子是用IL-6的重組蛋白刺激人外周血15分鐘后看STAT3第705位酪氨酸的磷酸化水平，在刺激完樣本后就需要通過固定來實(shí)現(xiàn)目的氨基酸磷酸化水平“停留”在IL-6刺激15分鐘這個(gè)節(jié)點(diǎn)上。

左圖：未用IL-6刺激，細(xì)胞固定后染色；右圖：用IL-6刺激15分鐘，細(xì)胞固定后染色。

2. 常用的固定劑有哪些？

脫水劑類（如乙醇、甲醇）

可以溶解脂類物質(zhì)，使細(xì)胞脫水，使蛋白沉淀到細(xì)胞結(jié)構(gòu)上，后續(xù)染細(xì)胞內(nèi)指標(biāo)不需要額外的破膜步驟；這類固定劑會(huì)使蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，很容易造成抗體識(shí)別的表位發(fā)生改變，從而影響一部分抗體的染色效果。

交聯(lián)劑類（如甲醛、戊二醛）

通過自由氨基基團(tuán)把分子橋連起來，從而能夠保持大多數(shù)目標(biāo)蛋白/抗原構(gòu)象的完整性；但也會(huì)使識(shí)別某些氨基酸殘基的抗體不能與這些基團(tuán)結(jié)合，所以后續(xù)胞內(nèi)指標(biāo)的染色除了需要先用破膜試劑進(jìn)行打孔外，染色的過程也需要在破膜劑中進(jìn)行。此類固定劑中最常見的是4%多聚甲醛溶液，其有效成分實(shí)際上就是甲醛。

3. 流式實(shí)驗(yàn)中固定會(huì)遇到的問題及應(yīng)對建議？

理想的固定劑能使抗原固定，同時(shí)保持細(xì)胞、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的真實(shí)性，同時(shí)能夠保證抗體與所有細(xì)胞及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)抗原的充分接觸。但“理想很豐滿，現(xiàn)實(shí)很骨干”，固定的過程或多或少對流式檢測帶來一些影響，只有了解了固定對流式染色帶來的影響我們才能更好的做好流式實(shí)驗(yàn)。

固定對熒光染料的影響是什么？

主要表現(xiàn)在固定劑對串聯(lián)染料（tandem-dye，如APC/Cy7、PE/Cy7等）的影響：一個(gè)是固定劑有可能造成串聯(lián)染料的斷裂，比如APC-Cy7和4%多聚甲醛溶液接觸時(shí)間超過4個(gè)小時(shí)染料就有可能斷裂，所以如果細(xì)胞直接重懸在固定液里面建議盡快上機(jī)，如果要放到第二天上機(jī)，需離心去除固定液后重懸在流式染色液或者是PBS里面，當(dāng)然有一些新的串聯(lián)熒光素可以有效減少這種情況，比如BioLegend的APC/Fire750^TM染料。

另外一個(gè)是固定劑有可能造成串聯(lián)染料的熒光“溢漏（spillover）”增加，對于這類情況的建議是配色允許的情況下減少串聯(lián)染料的使用（但實(shí)際上很多多色panel來說，這都不算是一個(gè)解決方案）；另外，使用一些商業(yè)化的固定buffer，也有可以在一定程度上減少熒光“溢漏”，如下圖所示：

4%多聚甲醛溶液固定后的樣本可以保存多久？

一般建議不要超過24個(gè)小時(shí)，固定后的樣本放置時(shí)間越久，背景信號(hào)會(huì)越高，即使固定后的細(xì)胞重懸在不含固定劑成分的緩沖液中也會(huì)造成背景升高（我們建議固定后的樣本離心除去固定劑，重懸在流式染色緩沖液或者PBS里面）。

如果需要長時(shí)間保存樣本，建議在樣本做完表面染色和固定后，保存在專門的保存緩沖液中。但即便是有專門的保存buffer，對于用了串聯(lián)染料（如APC/Cy7、PE/Cy7等）染色的樣本，我們還是建議不要長時(shí)間保存，很難避免補(bǔ)償?shù)摹捌疲?/span>shift）”。

左圖：human PBMC刺激完當(dāng)天染色后上機(jī)檢測；右圖：同一樣本，表染和固定后，保存在Cyto-Last? buffer里面，14天后做胞內(nèi)染色并上機(jī)。

Ki-67染色時(shí)，選擇哪種固定方式？

流式在檢測一些特殊的核內(nèi)指標(biāo)時(shí)，一般都會(huì)有推薦的固定破膜方案。比如在Ki-67染色一般會(huì)推薦用70%的冰乙醇作為固定劑（含打孔作用），如前文提到的脫水劑類固定劑對蛋白空構(gòu)象的影響大，在單染Ki-67的時(shí)候，乙醇的固定方式是完全沒有問題的，但是在和其它指標(biāo)共染時(shí)，就需要考慮乙醇固定的方式和其它抗體兼容性的問題，比如CD38 (Clone: HIT2)的抗體是明確不能和乙醇固定的方式兼容，而CD34 (Clone: 581)很大程度上可以兼容這種固定方式。醇類和其它抗體（Clone）的兼容性很難一一驗(yàn)證，所以在做Ki-67染色的時(shí)候我們也會(huì)用FOXP3的固定/破膜方式來替代乙醇的方案，而且大多數(shù)時(shí)候是可以獲得不錯(cuò)的染色結(jié)果。

用BioLegend FOXP3 Buffer set對細(xì)胞進(jìn)行固定破膜處理后，染Ki-67抗體，左圖：小鼠淋巴結(jié)樣本；右圖：小鼠脾臟樣本。

對于需要先固定再染色的樣本，注意點(diǎn)在哪里？

流式實(shí)驗(yàn)中，有一些情況我們希望或需要對樣本進(jìn)行預(yù)先固定處理，比如前文說過的傳染病人的樣本或者是需要檢測蛋白翻譯后修飾的樣本。對于需要預(yù)固定的樣本，首先需要考慮預(yù)先固定處理對檢測指標(biāo)的影響，有很多指標(biāo)先染色再固定和先固定再染色出來結(jié)果差異非常大，導(dǎo)致這些差異原因和指標(biāo)的類型、抗體的克隆號(hào)等因素都有關(guān)系。

如果我們的流式實(shí)驗(yàn)要求對樣本進(jìn)行預(yù)先固定的處理，那實(shí)際上這就需要提前去驗(yàn)證染色方案里所選的克隆是否適用于先固定后染色，這也有一定工作量。推薦大家參考借鑒BioLegend關(guān)于固定的專題，里面有做了很多克隆能否適用于先固定后染色的驗(yàn)證。

對比信息請參考：www.biolegend.com/fixation

樣本需要先固定再染色，但方案里的一些指標(biāo)不兼容預(yù)先固定，該怎么辦？

這個(gè)問題其實(shí)相當(dāng)棘手，因?yàn)閾?jù)我們了解的情況，目前市面上還沒有一個(gè)試劑生產(chǎn)廠家有這樣“完美”固定試劑可以先固定樣本而不對后續(xù)染色產(chǎn)生任何影響，如果有的話，那我們今天所說的關(guān)于固定的問題，都不算是問題。

在實(shí)際遇到預(yù)固定和指標(biāo)不兼容時(shí)，我們會(huì)做如下建議：（1）使用替代指標(biāo)來更換那些受固定影響的指標(biāo)；（2）如果沒有可以替代指標(biāo)，請根據(jù)實(shí)驗(yàn)重要性原則來取舍檢測指標(biāo)，比如是磷酸化的指標(biāo)會(huì)比表面的指標(biāo)更為重要。雖然這一段看起來有一點(diǎn)像“廢話”，但我們需要在實(shí)際實(shí)驗(yàn)過程中學(xué)會(huì)做取舍和判斷。

4. 結(jié)語

流式實(shí)驗(yàn)中會(huì)碰到很多有意思的問題，小達(dá)君后續(xù)會(huì)慢慢進(jìn)行整理，并和大家做分享交流，也希望大家多與我們分享寶貴的經(jīng)驗(yàn)，共同提高！

參考文獻(xiàn)

Cossarizza A, Chang HD, Radbruch A, et al.Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunologicalstudies. Eur J Immunol. 2017 Oct; 47(10):1584-1797.
Li N, Hallde?n G, Hjemdahl P. A whole-blood flow cytometric assay for leukocyte CD11b expression using fluorescencesignal triggering. Eur J Haematol. 2000: 65:57±65.
Judith C. Stewart, Michelle L. Villasmil andMark W. Frampton. Changes in Fluorescence Intensity of Selected LeukocyteSurface Markers Following Fixation. Cytometry A. 2007 Jun;71(6):379-85.