逆轉(zhuǎn)錄PCR （ RT-PCR ）

逆轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR )具有靈敏性高、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，常用于基因定量分析、生物學(xué)檢測(cè)和克隆特定基因的cDNA序列等方面。

cDNA的合成是RT-PCR 的重要環(huán)節(jié)。以mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，隨機(jī)引物、oligo(dT)或基因特異性引物的引導(dǎo)下合成互補(bǔ)的DNA(complementary DNA，cDNA)，再按照普通PCR的方法設(shè)計(jì)兩條引物，以cDNA為模板，則可擴(kuò)增出不含內(nèi)含子的完整基因的序列。

逆轉(zhuǎn)錄PCR 的重要因素

不同的mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA的效率不同，適合某一種mRNA轉(zhuǎn)錄的條件可能對(duì)另一種mRNA不適合，因此，在進(jìn)行不均一mRNA反轉(zhuǎn)錄時(shí)，下面的參數(shù)非常重要。

一、逆轉(zhuǎn)錄酶

常見的逆轉(zhuǎn)錄酶有四大類：

• 第一種來自純化的禽成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)，由兩條肽鏈組成，具有聚合酶活性和很強(qiáng)的RNase H活性，它最適溫度是42℃，最適pH8.3。在高反應(yīng)溫度時(shí)可消除mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)逆轉(zhuǎn)錄的阻礙，因此適合用來擴(kuò)增比較復(fù)雜的模板，但是由于AMV具有高水平的RNase H的活性，RNaseH同反轉(zhuǎn)錄酶相互競(jìng)爭(zhēng)RNA模板與DNA引物或cDNA延伸鏈間形成的雜合鏈，并降解RNA（RNase H可特異性消化DNA-RNA雜合鏈中的RNA），被降解的RNA模板不能再作為合成cDNA的有效底物，所以AMV不適合太長(zhǎng)片段cDNA的合成。

• 第二種來源于鼠白血病病毒(MMLV)，它是單肽鏈的，有RNA聚合酶活性和相對(duì)較弱的RNase H活性。該酶最適反應(yīng)溫度為37℃，最適pH為7.6。由于具有較弱的RNase H活性，因此使用該酶能得到較長(zhǎng)的cDNA片段（2-3kb），但是MMLV對(duì)熱的穩(wěn)定性差。

• 第三種來自Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩(wěn)定性反轉(zhuǎn)錄酶，在Mn²⁺存在下，可以高溫進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以消除RNA模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

• 第四種是MMLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNaseH-突變體，此種酶與其它酶相比，能更多的將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。這一特性使得研究者能從含二級(jí)結(jié)構(gòu)的、低溫反轉(zhuǎn)錄很困難的mRNA模板中合成較長(zhǎng)的cDNA。

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EpiScript? Reverse RNase H- Transcriptase（Cat# ERT12925K，Lucigen）

1. 是一種重組的MMLV反轉(zhuǎn)錄酶，降低了RNase H的活性；

2. 該酶能夠高效的從長(zhǎng)的RNA模板合成全長(zhǎng)cDNA；

3. 比其他MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶具有明顯高的活性；

4. 該酶能夠從低至50 pg的總RNA中合成cDNA；

5. 試劑盒中含有10X RT Reaction Buffer和100mM DTT；

二、合成 cDNA的引物

合成cDNA的引物一般分為三大類：

• 隨機(jī)引物：某些特定mRNA由于含有使反轉(zhuǎn)錄酶終止的序列，比較難以轉(zhuǎn)錄成全長(zhǎng)序列時(shí)，可采用非特異的隨機(jī)引物來轉(zhuǎn)錄全長(zhǎng)mRNA。選擇這種引物，體系中所有RNA分子會(huì)全部充當(dāng)DNA第一鏈模板，然后PCR引物在下游擴(kuò)增過程中再擴(kuò)增特異的目的基因。通常，用此引物合成的cDNA中，96%來源于rRNA。

• Oligo(dT)：絕大多數(shù)真核細(xì)胞的mRNA具有3’端Poly(A+)尾，所以使用Oligo(dT)僅mRNA可被轉(zhuǎn)錄。由于Poly(A+)RNA僅占總RNA的1-4%，所以用這種引物合成的cDNA比隨機(jī)引物得到的cDNA量少、復(fù)雜性小。

• 特異性引物：以目標(biāo)RNA互補(bǔ)序列的寡核苷酸作為引物，用此類引物僅生成所需要的cDNA，產(chǎn)生PCR產(chǎn)物更為特異。

三、緩沖液及dNTPs

緩沖液中的離子濃度會(huì)影響各種模板的轉(zhuǎn)錄效率。一般情況下，用鉀離子比用鈉離子可獲得較長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。另外，使用高濃度、高純度的四種脫氧核苷三磷酸(dNTP)對(duì)于有效合成cDNA也是特別重要的。

逆轉(zhuǎn)錄PCR選擇一步法還是兩步法？

RT-PCR 的實(shí)驗(yàn)操作分為“一步法”與“兩步法”兩種：

一步法RT-PCR 能克隆微量mRNA而不需合成cDNA，省略了cDNA與PCR之間的過程。兩步法RT-PCR首先用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，然后以cDNA為模板進(jìn)行PCR，即RNA 反轉(zhuǎn)錄與PCR 擴(kuò)增分兩步進(jìn)行。

一步法RT-PCR與兩步法相比快速、簡(jiǎn)便、減少了污染機(jī)會(huì)、減少了RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、減少了PCR 反應(yīng)的錯(cuò)配率。兩步法RT-PCR的優(yōu)勢(shì)在于可獲得中間產(chǎn)物cDNA，便于保存；且第二步PCR只需取逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物的1/10進(jìn)行反應(yīng)，有利于PCR條件的調(diào)整，便于重復(fù)試驗(yàn)；兩步法可以在第二步PCR反應(yīng)體系中加入特異性引物，其靈敏度比一步法高；兩步法的實(shí)驗(yàn)預(yù)算要低于一步法。但是由于兩步法包括第一鏈cDNA合成和隨后的PCR反應(yīng)，容易產(chǎn)生污染問題。

下一篇我們將分享逆轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)驗(yàn)過程中注意的問題與解決方案，敬請(qǐng)期待哦~

達(dá)科為逆轉(zhuǎn)錄PCR優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品推薦（一）

美國(guó)Lucigen公司成立于1998年，提供各類用于分子生物學(xué)相關(guān)產(chǎn)品，可以使研究者成功克隆較難克隆的基因，其在2016年收購(gòu)了Illumina旗下Epicentre產(chǎn)品線。目前產(chǎn)品類別主要包括：體外轉(zhuǎn)錄、基因克?。?/span>BAC克隆試劑盒）、感受態(tài)細(xì)胞（TG1噬菌體文庫構(gòu)建感受態(tài)）、體外擴(kuò)增、轉(zhuǎn)座子突變、蛋白表達(dá)、文庫構(gòu)建等。