一、細(xì)胞處理

接下來，我們會從細(xì)胞的來源，如何培養(yǎng)，以及使用的培養(yǎng)基等幾個方面詳細(xì)的給大家介紹一下細(xì)胞樣本是如何處理的。

1. ELISpot 和 FluoroSpot適用于多種細(xì)胞類型

細(xì)胞可以來源于各種來源以及不同的物種。比如培養(yǎng)的細(xì)胞系、人的全血或小鼠的脾臟。來自于粘膜組織的細(xì)胞也能應(yīng)用于ELISpot。同時來源于不同物種的靜脈血和脾臟細(xì)胞也可用于ELISpot，例如猴子、小鼠、大鼠、牛、馬、羊、豬等。

2. 較常用的細(xì)胞--外周血單個核細(xì)胞（PBMC）

我們可以很容易地通過密度梯度離心法從血液中獲得外周血單個核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cells, PBMC）。提取出來的PBMC可以直接使用，也可以被凍存，用于以后的ELISpot/FluoroSpot實驗。對于人來源的PBMC樣本，血液樣本中應(yīng)該加入檸檬酸鈉抗凝或者直接使用肝素抗凝管收集。

3. 細(xì)胞的質(zhì)量是影響實驗結(jié)果至關(guān)重要的因素

在活細(xì)胞中，細(xì)胞凋亡的比例都不高，能夠正常的分泌蛋白質(zhì)，不會對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響。細(xì)胞處理過程的標(biāo)準(zhǔn)化對于成功的細(xì)胞檢測是至關(guān)重要的，特別是對于ELISPOT/FLUOROSPOT實驗。從血液樣本中提取出來的PBMC，超過3小時就可能被活化的粒細(xì)胞污染，進(jìn)而影響實驗結(jié)果。

解決這一問題的三種方法：

①在保存過程中輕輕攪拌血液樣品；

②在保存樣本前，用PBS或RPMI1:1稀釋血液樣本；

③在檢測前去除血液樣本中的粒細(xì)胞。

4. 實驗中可以使用凍存的細(xì)胞

在 ELISPOT 檢測的應(yīng)用中，往往需要用到凍存的淋巴細(xì)胞樣品作為檢測細(xì)胞。由于 ELISPOT檢測的是細(xì)胞的免疫功能，不僅僅需要保持細(xì)胞的存活率，而且還要保證細(xì)胞的功能不發(fā)生變化。傳統(tǒng)的細(xì)胞凍存方法通常是為了保存細(xì)胞株，對細(xì)胞存活率的要求不高，更沒考慮保持細(xì)胞原有的免疫狀態(tài)，所以傳統(tǒng)的細(xì)胞凍存方法已經(jīng)不能滿足 ELISPOT 檢測的要求。

5. 細(xì)胞復(fù)蘇

細(xì)胞凍存和復(fù)蘇都會導(dǎo)致不同數(shù)量的細(xì)胞死亡，這在我們復(fù)蘇后并不能馬上觀察到。我們建議復(fù)蘇后的細(xì)胞在37°C新鮮的培養(yǎng)基中放置1小時或更長時間。 這樣細(xì)胞碎片就可以很容易地被去除，并提高了檢測性能。

二、ELISpot和FluoroSpot的血清和培養(yǎng)基

細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境能夠影響我們的實驗結(jié)果，其中培養(yǎng)基起著至關(guān)重要的作用。請考慮以下方面，以產(chǎn)生高效的細(xì)胞培養(yǎng)物。

1. 培養(yǎng)基

用于ELISpot和FluoroSpot的細(xì)胞培養(yǎng)基應(yīng)與待測細(xì)胞相容。 RPMI培養(yǎng)基常與血清一起使用。如果在細(xì)胞培養(yǎng)過程中CO2受到限制，可以加入HEPES以維持細(xì)胞培養(yǎng)的pH值。通常推薦使用青霉素和鏈霉素等抗生素來降低污染的風(fēng)險。

2. 血清

我們應(yīng)選擇一些既可以支持細(xì)胞培養(yǎng)，同時背景值又比較低的一些血清。并且血清本身不應(yīng)引起非特異性的細(xì)胞活化或蛋白分泌。我們建議使用胎牛血清。血清批次間可能會有所不同，在ELISpot和FluoroSpot實驗前我們最好測試一下新的批次。我們一般推薦血清熱滅活。不推薦人血清，因為它可能含有能干擾檢測的異嗜性抗體或固有分析物。

3. 無血清培養(yǎng)基---消除血清中不確定成份的影響

 含替代血清成分從而提高細(xì)胞培養(yǎng)和實驗結(jié)果的重復(fù)性：

▲維持淋巴細(xì)胞存活，保持細(xì)胞活力和免疫功能狀態(tài)

▲不會額外刺激陰性細(xì)胞產(chǎn)生額外產(chǎn)生任何一種細(xì)胞因子

▲不會抑制陽性細(xì)胞分泌各種因子

產(chǎn)品優(yōu)勢：

▲成分固定，徹底消除了批次間的差異。

▲不含雜蛋白，背景更弱，斑點更清晰。

▲不含抑制細(xì)胞因子分泌成分，斑點更多，更加反映真實的結(jié)果。

三、細(xì)胞稀釋指南

1. 活細(xì)胞計數(shù)

用臺盼藍(lán)或細(xì)胞計數(shù)儀檢測活細(xì)胞的數(shù)量。評估凋亡細(xì)胞的數(shù)量是一個優(yōu)勢。

2. 計算需要的細(xì)胞數(shù)

計算所需的細(xì)胞數(shù)量和所需的體積。建議制備過量的細(xì)胞懸浮液（10-20%），以確保有足夠的體積用于實驗。

3. 加入適量的培養(yǎng)基

將培養(yǎng)基加入到細(xì)胞懸浮液中。用于T細(xì)胞檢測的細(xì)胞濃度通常在0.5×106/ml和3×106/ml之間。

4. 混勻

充分混勻細(xì)胞懸液。

5. 將細(xì)胞懸浮液移到孔板中

在向孔板中加入細(xì)胞之前，應(yīng)該先添加刺激物。另一種方法是將細(xì)胞和刺激物充分混勻后再加到孔板中。將細(xì)胞懸浮液移到孔板中。如果同時操作一個以上的孔板，應(yīng)在加入細(xì)胞懸液前在重新混勻一下細(xì)胞懸液。一個孔板大約需要12ml。

建議稀釋的步驟:

四、細(xì)胞孵育

1. 細(xì)胞數(shù)

每個孔中細(xì)胞的數(shù)量必須與細(xì)胞類型和細(xì)胞分泌的頻率相適應(yīng)。如果頻率非常低，例如在10000個細(xì)胞中有1個，那么我們就需要更多數(shù)量的細(xì)胞，通常有250000個細(xì)胞/孔。當(dāng)頻率較高時，例如在10個細(xì)胞中就有1個，那么我們僅需要大約5000個細(xì)胞/孔就足夠了。

2. 測定細(xì)胞線性度

在分析中，如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞沒有成線性關(guān)系，可能是由于細(xì)胞數(shù)量不夠，或者細(xì)胞刺激不夠造成的。比如當(dāng)分析抗原特異性T細(xì)胞時，PBMC細(xì)胞數(shù)不應(yīng)低于每孔200000個細(xì)胞。

3. 激活

在加入細(xì)胞之前，應(yīng)將刺激物添加到孔板中，或者刺激物與細(xì)胞混勻后一起加入到孔板中。細(xì)胞被添加到孔板中后就不能再添加更多的培養(yǎng)基，因為后加入的培養(yǎng)基會使細(xì)胞向邊緣周圍擴(kuò)散。在ELISPOT/FLUPOSBOT讀板前，應(yīng)清洗細(xì)胞以避免膜的背景染色。在B細(xì)胞ELISPOT實驗中洗板是很重要的。

4. 動力學(xué)

在建立適合細(xì)胞孵育時間時，應(yīng)考慮蛋白質(zhì)分泌的動力學(xué)因素。某些分析物僅在刺激超過24小時后才會分泌。

5. 濕度

我們要確保足夠的濕度來培養(yǎng)細(xì)胞。建議培養(yǎng)過程中用錫箔紙包裹孔板，避免蒸發(fā)。一般的建議，37°C ，5% CO2孵育細(xì)胞。

6. 靜置

避免細(xì)胞在培養(yǎng)過程中突然移動，因為這將對斑點的形成產(chǎn)生不利的影響。

前三期詳情請參考：

ELISpot Part 1——ELISpot原理、優(yōu)勢及品牌推薦

ELISPOT Part 2-T細(xì)胞、B細(xì)胞ELISPOT介紹以及Mabtech相關(guān)產(chǎn)品

ELISpot Part 3——ELISpot的對照設(shè)置及不同的刺激物簡介