在細(xì)胞分選中，陰選通常是指對(duì)非目的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記和去除，來得到目的細(xì)胞。避免通過直接的標(biāo)記目的細(xì)胞（比如使用表面特異性抗體標(biāo)記），從而來減少細(xì)胞活化可能。因此，陰選方法的優(yōu)勢(shì)在于可以保持目的細(xì)胞未受刺激的原始狀態(tài)，分選速度快。不過相對(duì)陽選而言純度稍低，而且需要事先對(duì)原始樣品的細(xì)胞組分有所了解，準(zhǔn)備相應(yīng)的標(biāo)記抗體。

本文將分享一種新的陰選方法和相關(guān)數(shù)據(jù)，利用Strep-Tactin^?TACS的瓊脂糖層析柱，這種層析柱既可用于細(xì)胞陽選，也能用于細(xì)胞陰選中。
 

為了評(píng)估Strep-Tactin^?TACS瓊脂糖柱細(xì)胞陰選的效率，實(shí)驗(yàn)從外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）樣品中富集了CD3- CD56+自然殺傷細(xì)胞（NK）。材料為Strep-Tactin^?TACS瓊脂糖柱以及生物素化的抗體，僅10分鐘，便完成了細(xì)胞陰選 （圖1）。
 

流程如下

 

陰選流程：生物素化抗體與PBMC孵育標(biāo)記非目的細(xì)胞，加入至親和層析柱后，即可收集目的細(xì)胞

• 將1 x 107 的PBMC細(xì)胞用100μl的Buffer稀釋（Buffer CI：含0.5％ BSA的PBS緩沖液，1 mM EDTA）

• 加入多種生物素化抗體，室溫下孵育5分鐘。生物素化的抗體包含以下幾種，每種抗體0.5 μg：CD235a (erythrocytes), CD14 (monocytes), CD3 (T cells), CD15 (granulocytes), CD19 (B cells), CD36 (thrombocytes), CD123 (hematopoietic stem cells) 和CD279 (PD-1)。

• 將孵育好的樣品加入到1 ml的Strep-Tactin^?TACS瓊脂糖層析柱上（柱子最大結(jié)合能力：1 x 108個(gè)細(xì)胞）。

• 當(dāng)樣品完全進(jìn)入柱子后，加入10 ml Buffer洗脫兩次，就可以得到未結(jié)合的細(xì)胞了。后續(xù)使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)富集的NK細(xì)胞。 

（此處用到的試劑見文末）

結(jié)果與討論

NK細(xì)胞從6％的起始豐度（圖2A）通過富集達(dá)到了86％（圖2B）。所有抗體標(biāo)記的細(xì)胞群幾乎均去除，剩余的非NK細(xì)胞主要成分為未標(biāo)記的細(xì)胞。數(shù)據(jù)表明， Strep-Tactin^?TACS瓊脂糖柱不僅可以在陽選中使用，還可以搭配適當(dāng)?shù)目贵w標(biāo)記，有效進(jìn)行細(xì)胞陰選。
 

圖2：通過陰選富集PBMC中的CD56 + NK細(xì)胞。Strep-Tactin^?TACS瓊脂糖柱與生物素化抗體結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)NK細(xì)胞的富集，純度從6％（A）提高到86％（B）（n = 2）

實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)中使用的Strep-Tactin^?TACS親和層析柱，主要成分Strep-Tactin^?是鏈霉親和素（Streptavidin）的一種突變體，借助鏈霉親和素-生物素作用原理，Strep-Tactin^?與生物素（biotin）的親和力介于100 pM – 100 fM間。當(dāng)向含有的Strep-Tactin^?層析柱中加入生物素化的抗體時(shí)，便能將其固定在柱子中，特異性捕獲細(xì)胞，進(jìn)行陰選。

抗體的選擇

帶Twin-Strep-tag^?的單克隆抗體在生產(chǎn)和純化更便捷，還可以通過加入生物素來洗脫已經(jīng)結(jié)合在柱子上的細(xì)胞。并且，Twin-Strep-tag^?的單克隆抗體的位置相對(duì)更固定一些。

使用生物素化抗體好處在于其與Strep-Tactin^?的親和力相比之下更高，可以稍提高陰選效率，但是總體來說兩種類型的抗體對(duì)細(xì)胞陰選都是非常有效的。
 

圖：?jiǎn)慰寺】贵w用生物素（A）或Twin-Strep-tag^?（B）標(biāo)記，兩種都可以固定在Strep-Tactin^?TACS瓊脂糖層析柱中。

總而言之，作為靈活的細(xì)胞研究工具，Strep-Tactin?TACS瓊脂糖層析柱在細(xì)胞分選的應(yīng)用不僅限于陽選，還可以在陰選中結(jié)合多種生物素化抗體（或Twin-Strep-tag?標(biāo)記的抗體）一起使用。整個(gè)細(xì)胞分選過程只需10分鐘，是一種快速有效的細(xì)胞陰選方案。

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