1. 細(xì)胞凍存復(fù)蘇技術(shù)簡介

在ELISPOT檢測的應(yīng)用中，往往需要用到凍存的淋巴細(xì)胞樣品作為檢測細(xì)胞。由于ELISPOT檢測的是細(xì)胞的免疫功能，不僅僅需要保持細(xì)胞的存活率，而且還要保證細(xì)胞的功能不發(fā)生變化。傳統(tǒng)的細(xì)胞凍存方法通常是為了保存細(xì)胞株，對細(xì)胞存活率的要求不高，更沒考慮保持細(xì)胞原有的免疫狀態(tài)，所以傳統(tǒng)的細(xì)胞凍存方法已經(jīng)不能滿足ELISPOT檢測的要求。參見圖7.1。

考慮到ELISPOT檢測的特殊性，荷蘭U-CyTech公司經(jīng)過精心的研究與反復(fù)的驗證，推出了Cryostar?凍存試劑盒，在凍存液中添加了一系列對細(xì)胞有特殊保護(hù)作用的保護(hù)劑。達(dá)科為公司在接到Cryostar?凍存試劑盒之后，在我們的實驗室以及國內(nèi)數(shù)家客戶的實驗室做了細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的實驗，并且對復(fù)蘇之后的細(xì)胞做了ELISPOT檢測。結(jié)果表明，淋巴細(xì)胞的存活率超過90%，ELISPOT斑點形成頻率與新鮮細(xì)胞完全相同。參見圖6.1。

2005年底，在達(dá)科為公司與中國生物制品檢定所合作制備凍存的質(zhì)控細(xì)胞庫時，Cryostar?2005年底，在達(dá)科為公司與中國生物制品檢定所合作制備凍存的質(zhì)控細(xì)胞庫時，Cryostar?凍存試劑盒與本文的凍存復(fù)蘇技術(shù)經(jīng)受住了嚴(yán)格的考驗，細(xì)胞存活率達(dá)到95%。這表明，該項技術(shù)已經(jīng)完全成熟，可以用于建立大型凍存細(xì)胞庫（108-109cells）。

凍存試劑盒與本文的凍存復(fù)蘇技術(shù)經(jīng)受住了嚴(yán)格的考驗，細(xì)胞存活率達(dá)到95%。這表明，該項技術(shù)已經(jīng)完全成熟，可以用于建立大型凍存細(xì)胞庫（108-109cells）。

根據(jù)我們的實驗經(jīng)驗，完美的細(xì)胞凍存效果需要優(yōu)質(zhì)的凍存試劑盒加上嚴(yán)格規(guī)范的實驗操作。二者缺一不可，不可偏頗，千萬不要因為有了好的試劑盒而放松對實驗操作的要求。為了幫助國內(nèi)的客戶解決好細(xì)胞凍存的問題，達(dá)科為公司以Cryostar? 凍存試劑盒使用說明為例特此編撰這份詳細(xì)的細(xì)胞凍存、復(fù)蘇實驗操作手冊，僅供參考。

Cryostar?凍存試劑盒（貨號UH-F1002-050）的內(nèi)容如下：

    2 Cryostar? 重懸液(Cryostar? Resuspension Medium)，1瓶，液體，25ml。-20 °C長期保存，一旦開始使用，放置于4°C冰箱。

    2 Cryostar? 2×凍存液(Cryostar? 2× Freezing Medium)，1瓶，液體，25ml，-20 °C長期保存，一旦開始使用，放置于4°C冰箱。

    2 英文原裝操作手冊一本；中文詳細(xì)操作手冊一本。

2. 細(xì)胞凍存、復(fù)蘇的標(biāo)準(zhǔn)程序

l 實驗儀器：

    2 可控溫度細(xì)胞離心機(jī)離心機(jī)；

    2 血球計數(shù)板或者自動細(xì)胞計數(shù)設(shè)備； 

    2 細(xì)胞程序降溫盒Nalgene “Mr. Frosty”；

    2 -70°C冰箱；

    2 液氮罐；

    2 37°C水浴鍋。

l 耗材準(zhǔn)備

    2 15ml圓錐底聚丙烯（PP）離心管； 

    2 無菌的細(xì)胞凍存管，2ml，外螺旋；

l 試劑配制

    2 熱失活補體胎牛血清； 

    2 R0培養(yǎng)基：RPMI-1640培養(yǎng)基，含谷氨酰胺，加入1%雙抗，不加血清。

    2 達(dá)優(yōu)?無血清培養(yǎng)基：已經(jīng)含有谷氨酰胺和雙抗，打開即用。

    2 Cryostar?重懸液(Cryostar? Resuspension Medium)：含有細(xì)胞凍存保護(hù)成分，-20°C長期保存，4°C可以保存6個月。

    2 Cryostar? 2×凍存液（Cryostar? Freezing Medium）：含有細(xì)胞凍存保護(hù)成分以及DMSO，-20°C長期保存，4°C可以保存6個月。

    2 臺盼藍(lán)

l 細(xì)胞凍存程序

1. 將備用細(xì)胞凍存管做上詳細(xì)記號。細(xì)胞凍存管、細(xì)胞凍存盒、Cryostar? 重懸液、Cryostar? 2×凍存液放入4 oC熱平衡。

2. 對要凍存細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，然后4 oC，400g離心10 min。

3. （冰上操作）棄上清，根據(jù)細(xì)胞計數(shù)結(jié)果加入4 oC的Cryostar? 重懸液重懸，使細(xì)胞濃度調(diào)整到兩倍的凍存濃度（比如想要凍存的細(xì)胞濃度為：1×107 cells/ml，就用重懸液將細(xì)胞濃度調(diào)整到2×107/ml），然后將細(xì)胞吹打均勻。

注意：重懸液不含有DMSO，所以這一步動作可以稍微劇烈。

4. （冰上操作）然后逐滴加入等體積冰浴的Cryostar? 2×凍存液，（細(xì)胞濃度變?yōu)?×107 cells/ml）。

注意：一定要逐滴加入，避免溶液中DMSO濃度的劇烈變化，詳見后面的說明。

5. （冰上操作）以每只1ml細(xì)胞懸液的量分裝入在-20oC熱平衡過的凍存管，然后將凍存管的蓋子擰嚴(yán)實。否則液氮會滲漏進(jìn)來。

6. 立即將凍存管放入已在4oC熱平衡的凍存盒(“Mr. Frosty”)，然后將凍存盒放入-70oC冰箱內(nèi)。也可以將凍存管放于程序降溫儀中，以1oC/min的速率降溫到–70oC。

7. 24hr后，把-70oC保存的凍存管轉(zhuǎn)移到液氮中。

8. 將細(xì)胞在液氮罐中凍存位置記錄在實驗室的液氮設(shè)備管理單上。

l 細(xì)胞復(fù)蘇程序

1.血清、R0培養(yǎng)基需要在4oC熱平衡，Lympho-Spot?無血清培養(yǎng)基需要37oC熱平衡。15ml離心管需要4oC熱平衡。水浴鍋要預(yù)先調(diào)到37oC。

2.用夾子將細(xì)胞凍存管從液氮中取出。如果有液氮滲漏到凍存管中，要稍微擰開管蓋，讓氣化的液氮逃逸。

警告：據(jù)報道，有些凍存管在解凍時會發(fā)生爆炸，為了消除這種危險，建議實驗中只使用牢固的聚乙烯凍存管用于液氮保存。

3.用夾子持住凍存管，浸入37oC水浴鍋內(nèi)。輕輕晃動凍存管，注意管內(nèi)凍存細(xì)胞的融化情況。當(dāng)管內(nèi)的冰核還有黃豆大小的時候，取出來，轉(zhuǎn)移到超凈工作臺內(nèi)。用酒精棉擦拭管口，然后將凍存管插于碎冰之上。

注意：這一步對細(xì)胞存活率至關(guān)重要。既要盡快融化，以減少融化過程對細(xì)胞的損害；又要盡可能減少細(xì)胞在較高溫度停留的時間，以減少DMSO對細(xì)胞的毒害。切不可將凍存管放在在燒杯內(nèi)不管。

4.（冰上操作）用移液槍取1ml胎牛血清(4oC)，槍頭插到凍存管管底，緩慢地加入這一毫升血清。

5.（冰上操作）溫柔地將凍存管內(nèi)的細(xì)胞懸液吸取出來，轉(zhuǎn)移到一個預(yù)冷的15ml離心管內(nèi)。然后，用移液槍取1mlR0培養(yǎng)基(4oC)，槍頭插到離心管管底，緩慢地加入這一毫升培養(yǎng)基。然后換槍頭再重復(fù)兩次，一共向離心管管底加入3ml的R0培養(yǎng)基。

6. 蓋上離心管管蓋，輕輕上下顛倒混勻。然后緩慢的補加R0培養(yǎng)基到14ml，此時不再需要從管底加入了。補加滿，然后蓋上管蓋，輕輕的上下顛倒混勻。

7. 4oC，400g離心10min，棄上清，加入1ml Lympho-Spot?無血清培養(yǎng)基，混合均勻。

8.（優(yōu)化步驟，可以略過）如果細(xì)胞有成團(tuán)現(xiàn)象，這是由于死亡細(xì)胞釋放出來的DNA纏繞所致?？梢约尤?.1ml DNase(1mg/ml)，37 oC孵育10min。

9. 取20μl細(xì)胞懸液，臺盼藍(lán)活細(xì)胞計數(shù)，計算存活率（viability）。

       根據(jù)計數(shù)結(jié)果，補加Lympho-Spot?無血清培養(yǎng)基至所需要的細(xì)胞濃度，進(jìn)行ELISPOT檢測。