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您想了解的Strep-tag：Strep-Tactin?XT發(fā)展史都在這里！

作者：admin 信息來源：達科為日期：2019年06月18日打印字體：大中小

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有用過His-tag進行蛋白純化的人，或多或少都有這樣的經(jīng)驗 : 蛋白純度低、純化出來的蛋白失去原有結(jié)構(gòu)或功能受到影響、難以從哺乳類細胞表達系統(tǒng)中純化出目標蛋白…等，因此科學(xué)家開始嘗試以不同親和標簽進行蛋白純化。因為Strep-tag系統(tǒng)的純化過程溫和、目標蛋白純度高，且相容于多種表達系統(tǒng)的特性，愈來愈受到大眾的歡迎。但是，你知道Strep-tag這個純化系統(tǒng)是怎么發(fā)展而來的嗎? 這得從功能性抗體開始說起…

功能性抗體的出現(xiàn)

隨著生物制藥技術(shù)的發(fā)展，抗體也因此成為科學(xué)家研究的熱門領(lǐng)域。但在80年代初，功能性抗體的表達一直是個問題，酵母表達系統(tǒng)中表達出來的蛋白只有部分具有功能，在其他的微生物表達系統(tǒng)中，也沒有成功的先例。一直到80年代末，一個具有功能性的McPC603抗體的Fv片段終于成功的在E. coli中被表達出來¹。這一方法的出現(xiàn)，使得科學(xué)家能更快速的表達具有不同基因變異的抗體片段，并能對這些變異所引發(fā)的功能改變進行檢視。

抗體純化沒有想象中那么簡單

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將重組抗體片段表達出來之后，必須將此片段純化出來，當時多以親和層析法搭配目標抗體的抗血清(antiserum)進行蛋白純化，

但這一方法常常受到限制 : 在研究一個未知目標蛋白時，常出現(xiàn)沒有抗血清或是相容抗體的情況，這嚴重影響了實驗進度。為此，科學(xué)家嘗試找出更有效的一步純化法。首先，他們考慮在重組蛋白上加入短肽標簽(tag)，當時市面上已有myc、flag、KT3 epitope等標簽，但這些主要適用于偵測目標蛋白，純化蛋白效果非常有限，或非常昂貴。

隨著His-tag的問世，讓固定化金屬離子親合層析法(Immobilized Metal Affinity Chromatography, IMAC)純化目標蛋白變?yōu)榭赡?，這的確提高了蛋白純化的效率。

但是His-tag僅適用于純化，無法用于偵測目標蛋白，而且使用His-tag進行Fv片段純化時，高鹽濃度常使得Fv片段解離成兩個單體(V_L及V_H)，難以保持抗體的功能性及正確結(jié)構(gòu) ²。

更高能的短肽標簽呼之欲出

要解決這些問題，科學(xué)家需要找出一個具備以下功能的短肽簽。

1.能被融合到目標蛋白上，且不會影響蛋白功能

2.能直接以現(xiàn)有試劑偵測出來

3.與配體的結(jié)合穩(wěn)定、特異性高且容易控制。

經(jīng)過一番搜索，發(fā)現(xiàn)鏈霉親和素(Streptavidin)在特定情況下，能與不同短肽進行可逆性的結(jié)合，再加上其與生物素(biotin)極高的親合力，且與背景蛋白的非特異性結(jié)合機率低，鏈霉親和素已被應(yīng)用在許多檢測系統(tǒng)中，甚至能做為一個穩(wěn)定的介質(zhì)來固定蛋白。另外，鏈霉親和素在不同溶液條件中穩(wěn)定性好，較抗體來的高，所以能夠重復(fù)被利用。因此，90年代初，科學(xué)家開始尋找一個能與鏈霉親和素特異性結(jié)合的親和標簽²。

終于找到了第一代Strep-tag系統(tǒng) : Strep-tag vs Streptavidin

因先前已知可用E.coli系統(tǒng)表達出具有功能性的Fv片段¹，科學(xué)家又希望能確認標簽是否會影響蛋白功能，所以選擇了已知的D1.3抗體Fv片段做為實驗?zāi)Ｐ?，以便檢測加上的短肽標簽是否影響了這片段與其抗原結(jié)合的特性³。接著，一連串能與鏈霉親和素結(jié)合的標簽被接到VH domain上，大量篩選之后，得到了一個適用于進行一步純化的Strep-tag (Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly) ³，與生物素相比，Strep-tag和鏈霉親和素間的親和力較低，因此可以使用生物素衍生物Diaminobiotin，在生理條件下進行溫和洗脫。又因整個純化流程溫合，含鹽濃度低，純化出來的 Fv片段完整且功能不受影響³。除此之外，這個標簽還能被應(yīng)用在Western blot或ELISA實驗中，以鏈霉親和素酶偶聯(lián)物(Streptavidin-enzyme conjugates)來檢測純化出的Fv片段。后續(xù)也測試了以Strep-tag來純化抗體以外蛋白的可能性，證實了這個一步純化系統(tǒng)可以被廣泛使用在不同類型的蛋白上³。

因為不完美，所以有了第二代 : Strep-tag II vs Strep-Tactin^?

但Strep-tag僅能接在目標蛋白的C端，對于需將標簽接在N端或是蛋白內(nèi)部的實驗，非常的不實用。因此科學(xué)家進一步優(yōu)化了這個標簽，便有了現(xiàn)在被廣泛使用的Strep-tag II (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys)⁴。但即便足以用于蛋白純化，科學(xué)家對Strep-tag II與鏈霉親和素的結(jié)合強度低這點仍不甚滿意，因為在比較特殊的純化條件中效率會受影響。于是進行了鏈霉親和素的改造，發(fā)展出Strep-Tactin^?。Strep-Tactin^?:Strep-tag II的親和力較Streptavidin:Strep-tag II提升了近100倍，這個改變使得洗脫時需改用脫硫生物素(Desthiobiotin)⁵，但過程一樣溫合。這就是二代Strep-tag系統(tǒng)，在過去近20年間，逐漸被廣泛應(yīng)用于純化或偵測蛋白質(zhì)中，甚至發(fā)展出細胞分離檢測的方法⁶。

總覺得還能更好，一起看看第三代 : Twin-Strep-tag vs Strep-Tactin^?XT

即便親和力已提升，在某些狀況下，Strep-Tactin^?使用仍有所限制，尤其是在需要極高親和力的應(yīng)用之中，例如檢測蛋白質(zhì)間的交互作用、或是從目標蛋白濃度低的樣本中進行純化。因此科學(xué)家利用總結(jié)合力(Avidity)的原理，將兩個Strep-tag II以Linker連接在一起 : Twin-Strep-tag ⁷。這一新標簽的出現(xiàn)再度提升了目標蛋白與Strep-Tactin^?的鏈接強度，改善了低濃度樣本純化效果⁸，還能用于抓取蛋白復(fù)合體、檢測蛋白間的交互作用^{7, 9}。

美中不足的是，Strep-Tactin^?在變性條件下并不穩(wěn)定(例如:使用尿素時)，無法進行純化，且進行批量純化時，即使搭配Twin-Strep-tag，效果仍有改善的空間。為此，科學(xué)家再次改造了Strep-Tactin^?，得到與Twin-Strep-tag親和力更上一層樓的Strep-Tactin^?XT (XT意指extreme tight) 10。經(jīng)過這次的優(yōu)化，科學(xué)家首次創(chuàng)造出一個純化系統(tǒng)，其中標簽與配體的鍵結(jié)力幾近共價，但鏈結(jié)仍保持可逆 (注:Strep-tag II也能與Strep-Tactin^?XT結(jié)合)。因親和力的增加，即使經(jīng)過多次清洗步驟，蛋白也不會從Strep-Tactin^?XT上解離，提高了目標蛋白的得率。需注意的是，洗脫步驟必須使用生物素，但是整個純化流程與前幾代一樣溫合，純度超過95%，這就是新一代Strep-tag系統(tǒng)。用Strep-Tactin^?XT來純化時，得率及純度都提高；且Twin-Strep-tag搭配后還能用在Biacore芯片^{11, 12}、微量滴定板或ELISA中來固定蛋白，進行后續(xù)檢測，是一個多用途的親和標簽系統(tǒng)。

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Strep-tag與His-tag系統(tǒng)的比較

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參考文獻

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IBA Lifesciences公司簡介

IBA Lifesciences（德國）是后基因組時代表達克隆和蛋白質(zhì)純化技術(shù) 重要的供應(yīng)商之一。該公司的產(chǎn)品線分成三部分：一是開發(fā)了Strep-tag^?的通用技術(shù)平臺，可快速、多樣性地生產(chǎn)、純化和使用重組蛋白；二是細胞分選與擴增產(chǎn)品組合；三是定制化核酸合成服務(wù)。

【關(guān) 閉】

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